Les amplifications du gène de la pompe à efflux contournent la nécessité de multiples mutations cibles pour la résistance contre le double

Nature Communications volume 14, Numéro d'article : 3402 (2023) Citer cet article

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Les antibiotiques qui ont de multiples cibles cellulaires réduisent théoriquement la fréquence d'évolution de la résistance, mais les trajectoires adaptatives et les mécanismes de résistance contre ces antibiotiques sont peu étudiés. Ici, nous étudions ceux-ci chez Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (SARM) en utilisant l'évolution expérimentale après exposition à la délafloxacine (DLX), une nouvelle fluoroquinolone qui cible à la fois l'ADN gyrase et la topoisomérase IV. Nous montrons que la sélection pour coder les mutations de séquence et les amplifications génomiques du gène codant pour une pompe à efflux mal caractérisée, SdrM, conduit à une résistance élevée à la DLX, contournant l'exigence de mutations dans les deux enzymes cibles. Dans les populations évoluées, la surexpression de sdrM due à des amplifications génomiques contenant sdrM et deux gènes adjacents codant pour des pompes d'efflux entraîne une résistance élevée à la DLX, tandis que les pompes d'efflux adjacentes en auto-stop contribuent à la résistance croisée à la streptomycine. De plus, l'absence de sdrM nécessite des mutations dans les deux enzymes cibles pour faire évoluer la résistance à la DLX, et la sdrM augmente ainsi la fréquence d'évolution de la résistance. Enfin, les mutations et amplifications de sdrM sont sélectionnées de manière similaire dans deux isolats cliniques différents, indiquant la généralité de ce mécanisme de résistance à la DLX. Notre étude met en évidence qu'au lieu de taux réduits de résistance, l'évolution de la résistance aux antibiotiques à ciblage multiple peut impliquer des voies évolutives alternatives à haute fréquence, qui peuvent entraîner des altérations inattendues du paysage de la condition physique, y compris la résistance croisée aux antibiotiques.

L'émergence de la résistance aux antimicrobiens (RAM) est une menace majeure pour la santé mondiale. Un rapport récent indique qu'il pourrait y avoir eu plus d'un million de décès dans le monde dus à la RAM en 20191. Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (SARM) provoque un large éventail d'infections associées aux soins de santé et communautaires, avec des taux d'incidence et de et peuvent atteindre une résistance contre la plupart des antibiotiques disponibles2,3,4,5,6,7. Les déterminants de la résistance chez les bactéries sont généralement acquis soit par transfert horizontal de gènes, soit par mutations de novo, et les mécanismes comprennent la dégradation ou la séquestration des antibiotiques, la modification des composants cibles et la surproduction de pompes à efflux8,9,10,11. De plus, des duplications et des amplifications génomiques omniprésentes et instables peuvent entraîner une expression accrue d'enzymes modificatrices et de pompes à efflux qui confèrent alors une résistance aux antibiotiques et peuvent être sélectionnées lors d'une exposition aux antibiotiques12,13,14.

Une stratégie qui a été proposée pour réduire l'augmentation de la résistance aux antibiotiques consiste à développer des antibiotiques avec plus d'une cible, réduisant ainsi la fréquence d'évolution de la résistance15,16. Des études récentes ont identifié deux de ces antibiotiques à double ciblage qui ciblent l'intégrité de la membrane ainsi qu'une voie cellulaire supplémentaire et ont jusqu'à présent évité l'émergence d'une résistance en laboratoire17,18,19. Les topoisomérases bactériennes, l'ADN gyrase et la topoisomérase IV, ont également été proposées comme cibles potentielles pour les antibiotiques à double ciblage, et il a été démontré que le ciblage des deux enzymes peut inhiber l'évolution de la résistance et impliquer potentiellement de nouveaux déterminants de la résistance15,16,20,21 . Cependant, les mécanismes d'évolution de la résistance à ces antibiotiques multi-cibles et les trajectoires adaptatives sous-jacentes n'ont pas été caractérisés.

Les fluoroquinolones sont une classe d'antibiotiques largement utilisée, et la plupart des fluoroquinolones traditionnelles, telles que la ciprofloxacine et la lévofloxacine, ciblent préférentiellement l'ADN gyrase ou la topoisomérase IV22. La délafloxacine (DLX) est un antibiotique fluoroquinolone de 4e génération, qui cible à la fois les enzymes ADN gyrase et topoisomérase IV avec une puissance similaire23,24,25. En raison de ce double ciblage, on pensait que la résistance contre la DLX pourrait être peu fréquente24,26,27, mais la résistance à la DLX a récemment été observée dans des isolats cliniques de S. aureus28,29.

Dans cette étude, nous étudions l'évolution de la résistance du SARM aux antibiotiques à double ciblage, en utilisant l'évolution expérimentale de plusieurs populations de SARM indépendantes à des concentrations croissantes de DLX. Nous observons qu'en plus des mutations dans les enzymes ADN gyrase et topoisomérase IV, des mutations de séquence codante dans la pompe d'efflux de la superfamille facilitatrice majeure SdrM (Staphylococcus drug resistance), et des amplifications génomiques de sdrM et des pompes d'efflux voisines sepA et lmrS sont répandues dans le populations évoluées, et évoluent généralement plus tôt que les mutations canoniques. Les mutations de la séquence codante sdrM confèrent une résistance modérée à la DLX et augmentent l'évolutivité de cette résistance, tandis que les amplifications génomiques conduisent à une résistance élevée à la DLX. La variation du nombre de copies de la région amplifiée dépend de la pression sélective et provoque une hétérogénéité de population pour la résistance à la DLX. Nous constatons que si l'activité sdrM fournit l'avantage de remise en forme pour la sélection de ces amplifications génomiques lors de l'exposition à la DLX, l'auto-stop des pompes d'efflux voisines dans l'amplification génomique conduit à une résistance croisée contre la streptomycine aminoglycoside. De plus, nous montrons qu'en l'absence d'activité sdrM, la résistance à la DLX nécessite des mutations dans les enzymes ADN gyrase et topoisomérase IV, et se produit donc à une fréquence plus faible. Enfin, nous démontrons que les amplifications et les mutations génomiques de sdrM sont également courantes dans les populations d'un SARM et d'un isolat clinique de S. aureus sensible à la méthicilline (MSSA), chacun lors de la sélection pour la résistance à la DLX.

Nous avons développé dix populations indépendantes de la souche JE2 de SARM dans des concentrations croissantes de DLX pendant 7 à 10 passages quotidiens. La DLX inhibe à la fois les enzymes ADN gyrase et topoisomérase IV avec une puissance similaire, ce qui soulève la possibilité que la résistance à la DLX puisse se développer rarement27. Cependant, les dix populations ont pu se développer à des concentrations de DLX comprises entre 64 et 1024 × la concentration minimale inhibitrice (MIC) de la souche parentale JE2 (ensemble de données supplémentaire 1, voir Matériels et méthodes pour la nomenclature des souches). La souche JE2 avait une CMI de 0,133 ± 0,027 μg/ml dans le milieu MH2, ce qui est inférieur au seuil clinique de 0,25 μg/ml23,24,25. Trois isolats individuels du passage terminal de chaque population évoluée ont été testés pour la résistance à la DLX et tous les isolats ont montré des CMI DLX comprises entre ~ 2 et 33 μg / ml (Fig. 1a supplémentaire), confirmant l'évolution d'une résistance élevée à la DLX. Nous avons effectué le séquençage du génome entier sur ces isolats, ainsi que sur des isolats et des populations supplémentaires issus de passages antérieurs de l'évolution (ensemble de données supplémentaire 2). Comme prévu, plusieurs isolats et populations résistants présentaient des mutations dans les gènes codant pour les sous-unités de l'ADN gyrase (gyrA ou gyrB) ou de la topoisomérase IV (parC ou parE) ou des deux (Fig. 1). La plupart des polymorphismes mononucléotidiques (SNP) apparus dans ces cibles canoniques telles que S85P et E88K dans gyrA, R458L dans gyrB, E84K et A116V dans parC, et D432G et P585S dans parE sont situés dans la région déterminant la résistance aux quinolones (QRDR) de ces protéines et ont déjà été associés à la résistance aux fluoroquinolones26,30,31,32,33. Nous avons également identifié d'autres mutations telles que W592R dans gyrB, S520R dans parC et S437P dans parE chez nos mutants, qui pourraient être de nouveaux allèles de résistance à la DLX.

La présence de mutations dans les gènes codant pour les sous-unités de l'ADN gyrase (gyrA, gyrB) et les sous-unités de l'ADN topoisomérase IV (parC, parE), les trois allèles mutants sdrM1*, sdrM2* et sdrM3*, et une amplification génomique contenant sdrM, sont montrées pour populations issues de passages intermédiaires, ainsi que les trois isolats issus du passage terminal, pour les dix populations ayant évolué indépendamment. Pour chaque population indépendante, les passages antérieurs aux passages ultérieurs sont indiqués de gauche à droite. Les carrés bleus ou jaunes indiquent la présence de la mutation (SNP ou amplification) dans une population ou un isolat terminal, respectivement. Les concentrations terminales de DLX représentent les concentrations finales de l'expérience d'évolution (à quel point les isolats ont été obtenus).

Malgré les nombreuses mutations cibles canoniques, plusieurs isolats résistants ainsi que des populations issues de passages intermédiaires de la plupart des dix populations indépendantes ne portaient aucune mutation canonique dans les gènes codant pour les enzymes ADN gyrase ou topoisomérase IV ou présentaient des mutations dans une seule des enzymes. cibles (Fig. 1 et ensemble de données supplémentaire 2). Ceux-ci incluent tous les échantillons des populations 1, 3 et 6, ainsi que les populations des multiples passages précoces des populations 2, 4, 5, 7, 8 et 9. GyrA évolué* (gyrAE88K) ou parE* (parED432G) les allèles mutants ont conduit individuellement à une légère augmentation des CMI DLX jusqu'à 0, 4 μg / ml (Fig. 1b supplémentaire), ce qui suggère que d'autres gènes jouent probablement un rôle dans la résistance à la DLX dans plusieurs de nos populations évoluées.

Un examen plus approfondi de nos résultats de séquençage du génome entier a révélé que les mutations de la pompe à efflux SdrM (résistance aux médicaments de Staphylococcus) étaient courantes dans les populations évoluées (Fig. 1). SdrM est une pompe à efflux de la superfamille des facilitateurs majeurs (MFS)34. Il a été démontré que la surexpression de SdrM confère une augmentation de 2 fois des CMI de la norfloxacine et du bromure d'éthidium, cependant, cette pompe à efflux n'a pas été impliquée dans l'évolution de la résistance aux antibiotiques34. Contrairement aux mutations typiques de la pompe à efflux qui se produisent dans la région promotrice (ou dans un répresseur), nous avons observé que huit des dix populations évoluées contenaient l'une des deux mutations de séquence codant pour sdrM, Y363H (sdrM1*) ou A268S (sdrM2*), mais aucun des isolats évolués n'avait les deux (Fig. 1, ensemble de données supplémentaire 2), ce qui soulève la possibilité que ces deux mutations aient une fonctionnalité similaire. La population 6 présentait une mutation en amont de la séquence codante de sdrM (en position -164) qui peut affecter la régulation de l'expression de sdrM, en plus de la mutation A268S (sdrM3*).

L'alignement de la séquence d'acides aminés SdrM avec d'autres pompes d'efflux MFS connues à l'aide de la base de données du domaine conservé35 a montré que les résidus A268 et Y363 sont probablement situés dans la poche de liaison de la pompe d'efflux SdrM (Fig. 2 supplémentaire), ce qui suggère que les mutations affectent la liaison. de SdrM à DLX. La visualisation de la structure protéique prédite de SdrM à l'aide d'AlphaFold36,37 a indiqué que A268 et Y363 sont très proches l'un de l'autre (Fig. 3 supplémentaire).

En plus des allèles sdrM, l'analyse de la couverture des résultats du séquençage du génome entier a révélé que la couverture du gène sdrM était 2 à 5 fois plus élevée que la couverture moyenne du génome chez plusieurs mutants évolués, par rapport à ~ 1 × couverture dans le WT, indiquant une amplification du gène sdrM dans les dix populations évoluées (Fig. 1, jeu de données supplémentaire 2).

Nous avons construit des mutants de remplacement d'allèles sdrM individuels dans la souche JE2 de type sauvage (WT) et déterminé l'effet des allèles évolués sur la résistance et l'efflux de DLX. Les mutants construits avec les allèles sdrM1 * ou sdrM2 * ont montré une augmentation d'environ 2 fois de la résistance à la DLX, tandis que ceux portant l'allèle sdrM3 * (qui consiste à la fois en une mutation de séquençage intergénique et codante) ont montré une augmentation d'environ 4 fois (Fig. 2a). Nous avons mesuré la fluorescence intrinsèque de DLX38 pour déterminer indirectement la concentration intracellulaire de DLX (Fig. 4a supplémentaire). Nous avons calculé le taux d'efflux chez les trois mutants de remplacement allélique, ainsi que le WT et un mutant avec une insertion de transposon dans sdrM (sdrM :: Tn) comme témoins (Fig. 2b). Comme prévu, les souches WT et sdrM :: Tn avaient les concentrations de DLX intracellulaire les plus élevées, tandis que les trois mutants de remplacement d'allèles avaient des niveaux inférieurs, ce qui suggère que les allèles sdrM évolués entraînaient une augmentation de l'efflux. À l'aide d'un modèle mathématique simplifié, nous avons déterminé que les taux d'efflux DLX de sdrM1 *, sdrM2 * et sdrM3 * étaient ~ 2 à 9 fois plus élevés que sdrM :: Tn, tandis que le taux WT était similaire à sdrM :: Tn. (Fig. 4b supplémentaire).

a DLX MICs de WT, et les trois mutants de remplacement allélique sdrM dans M63. Les données présentées sont la moyenne ± écart type de cinq répétitions biologiques. La signification est montrée pour la comparaison avec le WT, ou entre les mutants comme indiqué, tel que testé par une ANOVA unidirectionnelle avec le test de Tukey pour des comparaisons multiples (*P < 0,05, P pour WT vs sdrM1 = 0,0138, WT vs sdrM2 = 0,0486, * *P < 0,01, sdrM1* vs sdrM3* P = 0,0015, ***P < 0,001, sdrM2* vs sdrM3* P = 0,0004, ****P < 0,0001). b La fluorescence normalisée (fluorescence intrinsèque de DLX/OD600) a été mesurée pour les souches indiquées, comme approximation de la concentration intracellulaire de DLX. Les données présentées sont la moyenne ± erreur standard de trois répétitions biologiques. c Pourcentage des 12 populations indépendantes des souches indiquées qui ont développé une résistance à la DLX au fil du temps lorsqu'elles ont évolué dans 2,5 fois les CMI DLX respectives. Les données source sont fournies dans le fichier Source Data.

D'après nos résultats de séquençage du génome entier, nous avons observé que dans huit des dix populations évoluées, des mutations sdrM (soit un SNP, soit l'amplification) sont apparues à un passage plus précoce par rapport aux mutations canoniques de l'ADN gyrase ou de la topoisomérase IV (Fig. 1). Cela suggère une cascade évolutive dans laquelle les mutations de la pompe à efflux facilitent la sélection des mutations canoniques pour la résistance à la DLX. Pour tester si les mutations sdrM peuvent affecter l'évolutivité de la résistance en présence de DLX, nous avons fait évoluer 12 populations indépendantes chacune de WT, et des mutants portant les allèles individuels sdrM ont évolué avec des passages quotidiens dans des concentrations fixes de délafloxacine, qui étaient 2,5 fois les CMI respectives. . Alors qu'une seule population WT a développé une résistance, 3 à 4 populations de sdrM1 *, sdrM2 * et sdrM3 * ont développé une résistance au cours de l'expérience (Fig. 2c).

Nous avons examiné la diversité allélique de la protéine SdrM pour déterminer si les allèles évolués que nous avons identifiés (A268S et Y363H), ou toute autre mutation dans la poche de liaison de SdrM, sont observés dans les génomes accessibles au public des isolats de S. aureus. La séquence de la protéine JE2 SdrM a été interrogée sur un ensemble de 63 980 génomes de S. aureus de la base de données NCBI Pathogen Detection. Bien qu'aucune mutation n'ait été observée en position Y363, nous avons identifié une souche avec une mutation A268S et sept autres souches avec une mutation A268V (ensemble de données supplémentaire 3). De plus, ces souches de S. aureus abritaient de nombreuses mutations dans d'autres résidus de la poche de liaison SdrM prédite.

En plus des mutations ponctuelles dans sdrM, nous avons identifié 13 types distincts d'amplifications à partir de nos données de séquençage du génome entier dans nos dix populations évoluées, qui ont amplifié le gène sdrM (Fig. 1 et 3a, Ensemble de données supplémentaire 4, Fig. 5 supplémentaire) . Au moins une instance de chaque type d'amplification a été confirmée par PCR et séquençage Sanger des nouvelles jonctions. Une extrémité de chaque amplification se trouvait dans un groupe de gènes ARNr-ARNt situé en aval de sdrM (terminal 1), tandis que l'autre extrémité se trouvait à l'intérieur ou entre les cinq gènes en amont de sdrM (terminal 2) (Fig. 3a). Alors que cinq de ces amplifications avaient une microhomologie de 4 à 12 paires de bases entre les deux terminaux, les autres avaient soit une homologie d'une seule paire de bases, soit aucune homologie (ensemble de données supplémentaire 4). Plusieurs des amplifications ont été trouvées dans plusieurs populations et dans certaines populations, différentes amplifications ont été observées dans différents passages, indiquant que les amplifications sont dynamiques (Fig. 6 supplémentaire). Le gène sdrM est présent en amont de deux pompes à efflux supplémentaires sepA et lmrS39,40, et ces deux gènes étaient présents dans les amplifications dans tous les cas (Fig. 3a). L'analyse du voisinage génétique à l'aide de la base de données STRING41 a indiqué que les trois pompes à efflux (ainsi qu'une protéine de la famille de l'hémolysine III) se trouvent côte à côte dans le génome de presque toutes les espèces de Staphylococcus (Fig. 7 supplémentaire).

a Le locus génomique sdrM et les 13 types distincts d'amplifications de gènes de pompe à efflux observés dans les populations évoluées. Les régions contenant les deux extrémités de l'amplification dans tous les cas sont représentées (bornes 1 et 2). b Couverture de lecture relative des régions amplifiées par rapport à l'ensemble du génome pour les souches indiquées. Les lignes représentent un ajustement lissé à l'aide d'un modèle additif généralisé prenant en compte les 100 voisins les plus proches. c Changement de pli du nombre de copies de sdrM, lmrS et sepA dans les isolats indiqués par rapport au WT tel que mesuré par qPCR de l'ADN génomique. Les données présentées sont la moyenne ± écart type de trois répétitions techniques. d Changement de pli dans l'expression de sdrM, lmrS et sepA dans les isolats indiqués par rapport à WT, tel que mesuré par RT-qPCR. Les données présentées sont la moyenne de deux répétitions biologiques. e CMI DLX des isolats indiqués dans M63. Les données présentées sont la moyenne ± écart type de trois répétitions biologiques. f Fluorescence normalisée (fluorescence intrinsèque de DLX/OD600) des souches indiquées, comme approximation de la concentration intracellulaire de DLX. Les données présentées sont la moyenne ± erreur standard de trois répétitions biologiques. La signification est indiquée pour la comparaison avec la valeur c WT définie sur 1 telle que testée par un test de Kruskal – Wallis suivi d'un test de Dunn non corrigé pour chaque comparaison et e WT tel que testé par les tests ANOVA unidirectionnels de Brown-Forsythe et Welch, suivi d'un test non apparié test t bilatéral avec correction de Welch pour chaque comparaison (*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001). c 1.7a : P pour sdrM = 0,0025, lmrS = 0,0079, sepA = 0,0025, 4.2a : P pour sdrM = 0,0279, lmrS = 0,0438 ; et e, P pour 1,7a = 0,0295, 4,2a = 0,0238, 6c = 0,006. Les données sources pour b–f sont fournies dans le fichier Source Data.

Pour caractériser davantage les effets des amplifications génomiques, nous avons analysé trois isolats évolués qui ne contenaient que des mutations non canoniques - 1.7a, 4.2a et 6c. On prévoyait que les trois isolats auraient des amplifications par pompe à efflux, où 1.7a avait une amplification de type 9 et 4.2a et 6c avaient une amplification de type 1 (Fig. 3b, jeu de données supplémentaire 4). Alors que 4.2a avait l'allèle WT sdrM, 1.7a avait l'allèle sdrM2 * et 6c avait ~ 40% de lectures cartographiant l'allèle sdrM3 * dans les données de séquençage du génome entier, ce qui suggère que l'amplification contenait à la fois les allèles WT et sdrM3 *. De plus, 1.7a et 6c présentaient des mutations dans quelques autres gènes non canoniques, mais ces mutations n'affectaient pas la résistance à la DLX (ensemble de données supplémentaire 2, Fig. 8 supplémentaire).

Les gènes sdrM, lmrS et sepA ont montré une augmentation de 3 à 10 fois du nombre de copies dans 1.7a, 4.2a et 6c, tandis qu'un isolat de contrôle évolué, 3a, dont on prévoyait qu'il n'aurait pas l'amplification, a montré une copie similaire nombre au WT, tel que mesuré par l'ADN génomique qPCR et les données de couverture du séquençage du génome entier (Fig. 3b, c, Fig. 9 supplémentaire). De plus, 1.7a, 4.2a et 6c ont montré une augmentation de 5 à 500 fois de l'expression génique des trois pompes à efflux par rapport à la souche WT, telle que mesurée par PCR quantitative de transcription inverse (RT-qPCR) (Fig. 3d). L'expression considérablement plus élevée par rapport au nombre de copies, en particulier dans 1.7a et 4.2a, reflète probablement une régulation altérée des pompes à efflux dans les amplifications. Les trois isolats présentaient une résistance à la DLX environ 5 à 100 fois plus élevée et un efflux de DLX élevé par rapport à la souche parentale WT (Fig. 3e, f).

Pour tester si la surexpression des pompes à efflux amplifiées individuellement ou en combinaison peut augmenter la résistance à la DLX, nous avons surexprimé sepA, lmrS ou les allèles sdrM parentaux ou évolués sous le contrôle des promoteurs natifs correspondants en utilisant le plasmide pKK3042. Dans ces souches, l'expression des pompes à efflux a augmenté d'environ 10 à 100 fois par rapport à un contrôle vectoriel vide (Fig. 10a supplémentaire). La surexpression de l'allèle WT sdrM a entraîné une augmentation d'environ 2 fois de l'activité et de la résistance de l'efflux DLX, tandis que les allèles sdrM1 *, sdrM2 * et sdrM3 * ont montré une augmentation d'environ 4 à 6 fois (Fig. 10b, c supplémentaires) . De plus, la surexpression de sepA et de lmrS n'a pas entraîné d'augmentation significative de la résistance à la DLX, et la surexpression des 3 pompes à efflux a entraîné une résistance similaire à la surexpression de l'allèle WT sdrM indiquant que la surexpression de sdrM est probablement le principal contributeur à la résistance à la DLX causée par les amplifications génomiques (Fig. 10b supplémentaire).

L'instabilité d'amplification provoque généralement des changements dans le nombre de copies, et par conséquent l'expression, qui peut dépendre de la force sélective des conditions environnementales12,14. Pour tester la stabilité de l'amplification, nous avons passé 1.7a et 6c dans deux concentrations de DLX ainsi que des milieux sans antibiotique pendant deux jours et avons déterminé la couverture de lecture sdrM pour chaque passage en utilisant le séquençage du génome entier. Le nombre de copies de sdrM a augmenté lors du passage dans DLX et a diminué lors du passage sans antibiotique, indiquant que le nombre de copies de sdrM, et probablement son expression, dans les amplifications génomiques dépend du niveau d'exposition à la DLX (Fig. 4a, b) . En outre, la fréquence des deux mutations de l'allèle sdrM3 * (mutation de la séquence codante A268S et mutation en amont) dans 6c a augmenté lors du passage DLX et a diminué lors du passage dans le milieu sans antibiotique (Fig. 4a). Les isolats qui avaient été passés pendant deux jours dans la concentration la plus élevée de DLX et avaient un nombre de copies d'amplification plus élevé, ont également montré une augmentation d'environ 2 fois de la résistance à la DLX pour 6c et une légère augmentation pour 1,7a (Fig. 4c, d ).

a Nombre de copies de sdrM et fréquences alléliques des deux mutations qui constituent l'allèle sdrM3 * en 6c lors du passage dans aucun milieu DLX ou deux concentrations de DLX. b Copiez le nombre de sdrM dans 1.7a lors du passage dans aucun support DLX ou dans deux concentrations de DLX. Les données de deux expériences de passage indépendantes sont présentées pour les deux. c, d CMI DLX dans M63 des populations 6c et 1.7a après le deuxième passage soit sans DLX, 4 μg/ml DLX (DLX 4) ou c 6 μg/ml DLX (DLX 6) pour 6c et d 8 μg/ml DLX (DLX 8) pour 1.7a. Les données présentées sont la moyenne ± écart type de deux répliques biologiques provenant chacune de deux expériences de passage indépendantes. e CMI de WT, 1.7a ou 1.7a cultivées pendant la nuit dans 2 μg/ml de DLX (1.7a_DLX) pour les antibiotiques indiqués dans MH2. Les données présentées sont la moyenne ± écart type de trois répétitions biologiques. f CMI de streptomycine des souches de surexpression de pKK30 dans MH2. Les données présentées sont la moyenne ± écart type de quatre répétitions biologiques. La signification est montrée pour la comparaison avec a–d le contrôle respectif sans DLX, e WT et f la souche portant le vecteur vide, comme testé par une ANOVA unidirectionnelle avec le test de Holm–Sidak pour des comparaisons multiples (*P < 0,05, * *P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001). a Pour la « couverture sdrM relative » DLX 4 μg/ml : P pour le passage 1 = 0,0012, le passage 2 = 0,0067, DLX 6 μg/ml : P pour le passage 1 = 0,001, le passage 2 = 0,0018 ; pour 'fréquence allélique de A268S' DLX 4 µg/ml : P pour passage 1 = 0,0052, passage 2 = 0,0164, DLX 6 µg/ml : P pour passage 1 = 0,0052, passage 2 = 0,0097 ; et pour « fréquence allélique de mutation intergénique » DLX 4 μg/ml : P pour passage 1 = 0,0018, DLX 6 μg/ml : P pour passage 1 = 0,0018 ; b, DLX 4 µg/ml : P pour passage 1 = 0,0312, passage 2 = 0,0020, et DLX 8 µg/ml : P pour passage 1 = 0,0092 ; dP pour DLX 8 µg/ml = 0,048 ; e, acriflavine : P pour 1.7a = 0,0025, 1.7a_DLX = 0,0002 ; chloramphénicol : P pour 1.7a_DLX = 0,0035 ; fP pour sdrM+lmrS+sepA = 0,0001. Les données source sont fournies dans le fichier Source Data.

Compte tenu de la présence de trois pompes d'efflux dans l'amplification et de leur expression élevée résultante, nous avons testé la résistance de 1.7a cultivé avec et sans DLX, contre un panel d'antibiotiques différents. Bien que nous n'ayons pas constaté d'augmentation de la résistance contre la plupart des antibiotiques, 1.7a cultivé dans DLX a montré une résistance croisée contre la streptomycine aminoglycoside (Fig. 4e). De plus, la surexpression des trois pompes d'efflux, mais pas de sdrM seul, a entraîné une augmentation similaire de la résistance à la streptomycine (Fig. 4f), indiquant que la résistance à la streptomycine nécessitait également une expression accrue de lmrS et de sepA.

La souche sdrM :: Tn n'avait pas de mutations supplémentaires par rapport au WT, a montré une croissance similaire au WT dans M63 (Fig. 11a, b supplémentaire) et avait un MIC ~ 2 fois inférieur au WT (Fig. 5a), indiquant que SdrM contribue au niveau de résistance intrinsèque à la DLX de la souche WT MRSA. Pour comprendre le rôle de sdrM dans la sélection des amplifications génomiques, nous avons fait évoluer trois populations indépendantes, chacune de la souche mutante transposon sdrM :: Tn et la WT (comme contrôle), à ​​des concentrations croissantes de DLX, similaires à notre évolution originale. Nous avons vérifié que l'insertion du transposon était stable au cours de l'évolution dans les trois populations évoluées sdrM :: Tn (Fig. 11c supplémentaire). Au cours de l'évolution, les populations ont augmenté à des concentrations de DLX d'environ 640 à 1 000 fois les CMI respectives, et les populations évoluées terminales pour le WT et le sdrM :: Tn ont montré des CMI de DLX élevées (Fig. 11d supplémentaire). Nous avons vu des amplifications génomiques du locus sdrM dans 2 des trois populations WT évoluées indépendamment. Alors que la 3ème population présentait également des jonctions associées à l'amplification, l'augmentation du nombre de copies était inférieure à notre seuil de 1,3 fois pour dénoter la présence d'une amplification. Chaque population WT avait un nouveau type d'amplification non observé dans l'évolution d'origine (ensemble de données supplémentaire 4). Cependant, aucune des populations sdrM :: Tn ne présentait ces amplifications (Fig. 5b). De plus, contrairement aux populations WT, toutes les populations séquencées des passages intermédiaires et terminaux des évolutions sdrM :: Tn présentaient des mutations dans les enzymes ADN gyrase et topoisomérase IV, suggérant que la résistance élevée à la DLX était due à des mutations à double cible, par opposition aux amplifications (Fig. 5b).

a CMI DLX des souches WT et sdrM :: Tn dans M63. Les données présentées sont la moyenne ± écart type de trois répétitions biologiques. La signification est indiquée pour la comparaison avec le WT tel que testé par un test t bilatéral non apparié (* P = 0,0112). b La présence de mutations dans les gènes codant pour les sous-unités d'ADN gyrase (gyrA, gyrB) et les sous-unités d'ADN topoisomérase IV (parC, parE), les trois allèles mutants sdrM1*, sdrM2* et sdrM3*, et une amplification génomique contenant sdrM, sont montrées pour les populations issues de passages intermédiaires de trois populations indépendamment évoluées, chacune des souches WT et sdrM :: Tn. c La fraction de survie pour les isolats indiqués dans plusieurs concentrations de DLX par rapport à un contrôle sans DLX, mesurée en cfu/ml sur les plaques respectives. Les données présentées sont la moyenne ± écart type de trois répétitions biologiques. d Pourcentage des 12 populations indépendantes des souches indiquées qui ont développé une résistance à la DLX au fil du temps dans 2,5 fois les CMI DLX respectives (0,55 µg/ml pour le WT et 0,32 µg/ml pour sdrM ::Tn). Les données sources pour (a, c, d) sont fournies dans le fichier Source Data.

Les amplifications sont connues pour être instables et sous-tendent généralement l'hétérorésistance aux antibiotiques dans les populations43,44, tandis que la résistance due aux modifications de la séquence d'ADN devrait être plus stable et homogène. Nous avons donc testé l'hétérogénéité de la population pour la résistance aux antibiotiques dans les isolats évolués 1.7a et 6c qui ont des amplifications génomiques mais pas de mutations cibles canoniques, ainsi qu'un isolat du passage final d'une population sdrM::Tn évoluée qui a des mutations dans gyrA, gyrB et parE (Fig. 5b, ensemble de données supplémentaire 2). Nous avons cultivé les isolats pendant la nuit dans des milieux sans antibiotiques, puis déterminé la fraction de la population qui pouvait se développer à différentes concentrations de DLX. Nous avons observé que, tandis que l'isolat évolué sdrM :: Tn (Tn_3b) présentait une résistance d'environ 100 % à la DLX à toutes les concentrations testées, 1.7a et 6c présentaient une hétérogénéité de population, où seulement environ 10 % ou moins de cellules étaient résistantes à la DLX (Fig. 5c) .

La présence de mutations dans les deux enzymes cibles dans toutes les populations sdrM :: Tn évoluées (Fig. 5b) suggère qu'en l'absence de sdrM, des mutations dans les deux cibles sont essentielles pour une résistance élevée à la DLX. Nous avons donc testé si la présence de sdrM affectait l'évolutivité de la résistance à la DLX, similaire à l'expérience testant les allèles sdrM évolués (Fig. 2c). Nous avons développé 12 populations indépendantes chacune des WT et sdrM :: Tn dans des concentrations fixes de DLX qui étaient 2,5 fois la CMI respective pour chaque souche (0,55 μg/ml pour WT et 0,32 μg/ml pour sdrM :: Tn), permettant un jour supplémentaire de croissance au jour 5 pour aider à l'évolution de la résistance. Alors que 5 des 12 populations WT ont développé une résistance à la DLX en 6 jours, seule 1 des 12 populations sdrM :: Tn a développé une résistance en 8 jours, ce qui indique que la présence de sdrM augmente l'évolutivité de la résistance à la DLX (Fig. 5d).

Nous avons testé deux isolats cliniques de S. aureus pour l'incidence des mutations sdrM et l'amplification lors de l'évolution de la résistance à la DLX. Les deux isolats cliniques de S. aureus ont été isolés à l'origine chez deux patients atteints de mucoviscidose. CF001 est une souche SARM du complexe clonal 8 (CC8) séquence de type 8 (ST8) et CF106 est une souche CC1 ST188 MSSA (ensemble de données supplémentaire 5). Alors que CF001 avait un DLX MIC ~ 2 × inférieur à notre souche WT JE2, le DLX MIC de CF106 était ~ 50 × inférieur à JE2 (Fig. 6a). Nous avons fait évoluer trois populations indépendantes chacune de CF001 et CF106 à des concentrations croissantes de DLX, et séquencé des populations à partir de passages intermédiaires (Fig. 6b). Deux des trois populations de CF001 et CF106 avaient l'allèle sdrM2 *, tandis que toutes les populations évoluées CF001 et CF106 avaient des amplifications génomiques sdrM.

a CMI DLX de JE2 (WT) et des deux isolats cliniques CF001 et CF106. Les données présentées sont la moyenne ± écart type de trois répétitions biologiques. La signification est indiquée pour la comparaison avec le WT tel que testé par une ANOVA unidirectionnelle avec le test de Holm-Sidak pour des comparaisons multiples (** P = 0,0024, **** P < 0,0001). b La présence de mutations dans les gènes codant pour les sous-unités d'ADN gyrase (gyrA, gyrB) et les sous-unités d'ADN topoisomérase IV (parC, parE), les trois allèles mutants sdrM1*, sdrM2* et sdrM3*, et une amplification génomique contenant sdrM, sont montrées pour les populations issues de passages intermédiaires de trois populations indépendamment évoluées des isolats cliniques CF001 et CF106. Les données source pour a sont fournies dans le fichier de données source.

La résistance aux antibiotiques ayant plus d'une cible cellulaire nécessite probablement de multiples mutations dans une cellule et devrait donc être peu fréquente. Cependant, les voies évolutives menant à la résistance contre de tels antibiotiques ne sont pas bien caractérisées. Dans cette étude, nous avons montré que l'évolution du SARM lors de l'exposition à la fluoroquinolone DLX à double ciblage de 4e génération entraînait une résistance via à la fois la séquence codante et des mutations en amont dans sdrM, le gène codant pour une pompe d'efflux de la superfamille facilitatrice majeure mal caractérisée, ainsi que amplifications géniques de sdrM. De plus, la présence de deux pompes d'efflux supplémentaires adjacentes au locus sdrM, et par conséquent leur auto-stop dans l'amplification génomique, a conduit à une résistance croisée contre la streptomycine aminoglycoside. En l'absence de sdrM, les souches nécessitaient des mutations dans les deux cibles canoniques, l'ADN gyrase et la topoisomérase IV, pour atteindre la résistance à la DLX, et avaient donc une évolutivité réduite de la résistance à la DLX. Les mutations et amplifications sdrM ont ainsi fourni une voie adaptative plus accessible vers une résistance élevée à la DLX. Nos résultats suggèrent que les antibiotiques à cibles multiples peuvent conduire par inadvertance à des trajectoires adaptatives alternatives qui non seulement permettent une évolution rapide de la résistance, mais conduisent également à des changements défavorables supplémentaires dans le paysage de la forme physique bactérienne.

On pense que les pompes à efflux fournissent une protection rapide aux cellules lors d'une exposition aux antibiotiques, et les mutations de la pompe à efflux sont généralement associées à la résistance aux antibiotiques45. Plusieurs pompes d'efflux de plusieurs familles de protéines sont présentes dans le SARM. Les pompes de la famille MFS comprennent NorA, NorB, NorC, LmrS, MdeA et SdrM codés par voie chromosomique, et la surexpression plasmidique de ces pompes peut conférer une résistance aux fluoroquinolones, aux composés d'ammonium quaternaire et aux colorants46,47. Alors que les mutations de norA ont été associées à l'évolution de la résistance aux antibiotiques, en particulier contre les fluoroquinolones48, les mutations de sdrM n'ont pas été impliquées auparavant. Notre étude montre ainsi que des pompes à efflux moins bien caractérisées peuvent jouer un rôle dans l'acquisition de la RAM, en particulier contre les antimicrobiens nouvellement développés. En outre, il avait été précédemment suggéré que la surexpression plasmidique de lmrS et sepA dans E. coli ou une souche de S. aureus sensible à la méthicilline pourrait entraîner une résistance accrue contre plusieurs antibiotiques, notamment le linézolide, l'érythromycine et la kanamycine39,40,49. Cependant, nous n'avons pas observé de résistance croisée contre ces antibiotiques dans nos isolats évolués qui surexprimaient ces pompes à efflux, indiquant que cette résistance peut être spécifique à E. coli ou à la souche de S. aureus.

Les mutations de la pompe à efflux associées à la résistance aux antibiotiques augmentent généralement l'expression de la pompe à efflux, réduisant ainsi les concentrations d'antibiotiques dans la cellule. De telles mutations sont le plus souvent localisées soit dans la région promotrice soit dans un répresseur de la pompe, bien que des amplifications génomiques des pompes d'efflux aient également été observées50,51. Dans nos évolutions, nous n'avons identifié aucune mutation du répresseur transcriptionnel qui augmenterait l'expression de sdrM, et une seule population avait une mutation en amont de sdrM, alors que les amplifications de sdrM étaient courantes dans les dix populations indépendamment évoluées. Cela suggère que l'augmentation substantielle de l'expression de sdrM requise pour une résistance élevée à la DLX est largement inaccessible via des mutations de promoteur ou de répresseur. Dans les isolats évolués avec amplifications, les niveaux d'expression de sdrM et des pompes à efflux adjacentes lmrS et sepA étaient beaucoup plus élevés par rapport au nombre de copies des gènes codants (Fig. 3c, d) suggérant que la régulation de ces gènes est altérée dans le amplification. Fait intéressant, un groupe de gènes ARNt-ARNr, qui sont généralement extrêmement fortement exprimés, est situé en aval de sdrM, lmrS et sepA, mais se positionne en amont des copies amplifiées des gènes codant pour la pompe à efflux. Cela soulève la possibilité que la transcription par lecture à partir des gènes ARNt-ARNr puisse entraîner l'expression de la pompe à efflux fortement accrue que nous avons observée dans nos isolats évolués contenant des amplifications, similaire à une observation précédente chez Streptococcus pneumoniae51.

Il a également été démontré que les mutations de la séquence codante dans les pompes à efflux augmentent la résistance aux antibiotiques chez Pseudomonas aeruginosa (mexB, mexY), Klebsiella pneumoniae (kmrA) et Neisseria gonorrhoeae (mtrD), probablement en raison d'une affinité accrue pour l'antibiotique52,53,54. Des études récentes ont suggéré qu'une expression accrue des pompes d'efflux pourrait également faciliter la résistance aux antibiotiques en augmentant le taux de mutation55,56, en permettant l'expression de déterminants de la résistance lors de l'acquisition du plasmide57 ou en favorisant la sélection de mutations de résistance en raison d'une meilleure forme physique lors de l'exposition aux antibiotiques de souches portant à la fois le mutations de résistance et pompes d'efflux surexprimant58. Nous avons également constaté que les mutations de la séquence codante dans la poche de liaison SdrM augmentaient la résistance et l'efflux de la DLX, probablement en modifiant la liaison à la DLX. La mutation en amont de sdrM3 * a probablement entraîné des niveaux élevés de la pompe à efflux sdrM, ce qui a entraîné une augmentation plus importante de l'efflux et de la résistance de la DLX (Fig. 2a, b). De plus, l'augmentation modérée de la résistance à la DLX des allèles mutants sdrM a entraîné une évolutivité accrue de la résistance à la DLX par rapport au WT, ce qui suggère que les mutations de la pompe à efflux de la séquence codante pourraient également faciliter l'évolution de mutations supplémentaires qui conduisent à des niveaux de résistance plus élevés. , peut-être en raison d'une augmentation synergique de la résistance ou de la forme physique élevée des mutants combinés. Enfin, nous avons montré que l'amplification de sdrM fournissait une voie adaptative en une seule étape à la résistance à la DLX, alors qu'au moins deux mutations, dans les enzymes ADN gyrase et topoisomérase IV, étaient nécessaires pour une résistance élevée à la DLX en l'absence de sdrM, et la présence de un gène sdrM fonctionnel a donc augmenté l'évolutivité de la résistance à la DLX. Alors que le niveau éventuel de résistance à la DLX atteint était similaire entre les souches WT et sdrM :: Tn (Fig. 11d supplémentaire), la présence de sdrM dans la WT a permis une évolution plus rapide et plus fréquente de la résistance à la DLX (Fig. 5d). Étant donné que les amplifications génomiques sont considérées comme beaucoup plus courantes que les mutations dans la séquence génomique12,14, il est probable que la combinaison d'une mutation et d'une amplification de la séquence codante sdrM soit également survenue plus fréquemment que la combinaison des mutations de la séquence codante dans les deux enzymes cibles.

De multiples mutations ont contribué à la résistance à la DLX dans nos populations évoluées, dont les déterminants les plus importants sont probablement les allèles évolués sdrM, les amplifications sdrM et les mutations canoniques dans les sous-unités ADN gyrase et topoisomérase. Au sein de ces catégories, les allèles spécifiques sdrM, gyrA, gyrB, parC et parE présents, ainsi que le nombre de copies d'amplification sdrM, affectent probablement les niveaux exacts de résistance observés. Des mutations uniques dans les enzymes gyrase ou topoisomérase, ainsi que des copies uniques des allèles sdrM évolués entraînent une augmentation de 2 à 4 fois du DLX MIC (Fig. 1b supplémentaire, Fig. 2a), tandis que des mutations dans l'ADN les enzymes gyrase et topoisomérase IV conduisent probablement à des CMI DLX élevées, 40 à 250 fois supérieures à la WT, comme on le voit dans les populations évoluées sdrM :: Tn (Fig. 5b). Les amplifications de sdrM conduisent de la même manière à une résistance élevée à la DLX, ce qui entraîne des CMI DLX 5 à 100 fois plus élevées que la WT (Fig. 3e). Nous avons observé une résistance à la DLX 3 à 9 fois plus élevée dans nos souches de surexpression de sdrM (Fig. 10b supplémentaire), qui était inférieure à la résistance des isolats évolués 1.7a, 4.2a et 6c (Fig. 3e). Cela était probablement dû à l'expression significativement plus élevée de sdrM observée dans certains de ces isolats évolués (Fig. 3d, Fig. 10a supplémentaire), ainsi qu'à l'augmentation du nombre de copies de l'amplification de sdrM lors de l'exposition à la DLX et aux augmentations ultérieures de l'expression de sdrM et Micros DLX (Fig. 4). Il est peu probable que la surexpression de sdrM à base de plasmide récapitule la nature dynamique des amplifications génomiques, empêchant ainsi une comparaison directe des niveaux de résistance entre les isolats évolués et les mutants de remplacement d'allèle et de surexpression construits.

Il existe une diversité significative parmi les souches de S. aureus isolées en clinique59, mais nos expériences montrent que lors de l'exposition à la DLX, la sélection pour les amplifications génomiques sdrM, et au moins l'allèle sdrM2*, est courante même dans les isolats cliniques de différents complexes clonaux. La DLX n'a ​​été approuvée que récemment (en 2017) pour une utilisation clinique par la FDA26 et, par conséquent, la sélection de la résistance à la DLX en clinique, et le séquençage ultérieur d'isolats résistants, ne sont pas encore courants. Les quelques isolats cliniques de S. aureus résistants à la DLX qui ont été identifiés et séquencés dans une étude précédente présentaient des mutations dans les enzymes ADN gyrase et topoisomérase IV28. Cependant, ces isolats ont été collectés avant l'approbation et l'utilisation clinique du DLX, et les pressions sélectives et les voies mutationnelles qui ont conduit à l'acquisition des mutations cibles sont donc inconnues. Une autre étude récente examinant des isolats cliniques de S. aureus résistants à la DLX a également identifié des mutations dans les sous-unités de l'ADN gyrase et de la topoisomérase IV, et a indiqué un rôle des pompes à efflux dans la résistance à la DLX dans au moins un isolat29. Notre analyse de plus de 63 000 génomes de S. aureus a également montré que si les mutations A268S et Y363H sont rares, d'autres mutations dans SdrM, y compris dans les résidus supposés se trouver dans la poche de liaison, sont abondantes. Ces mutations peuvent potentiellement affecter la résistance de S. aureus et l'évolution de la résistance à la DLX et à d'autres antibiotiques.

On estime que les duplications et les amplifications génomiques sont présentes dans 10 % des cellules bactériennes dans les cultures en croissance et, en raison de leur fréquence élevée, on pense qu'elles jouent un rôle important dans l'adaptation précoce au stress, y compris la résistance aux antibiotiques12,14. Notre étude démontre que les amplifications génomiques des pompes à efflux peuvent conduire à une résistance aux antibiotiques et peuvent constituer les premières étapes de voies évolutives permettant l'évolution rapide de mutations de résistance plus stables, en particulier lorsque plusieurs de ces mutations sont nécessaires pour des niveaux élevés de résistance.

Les amplifications génomiques sont généralement instables et fréquemment perdues en l'absence de pression sélective, ce qui entraîne une hétérogénéité de la population et une hétérorésistance aux antibiotiques43,44. Nous avons observé une instabilité d'amplification similaire dans notre étude, conduisant à une hétérogénéité de population de la résistance à la DLX. En outre, le traitement avec des concentrations élevées de DLX a entraîné une augmentation du nombre de copies d'amplification et, par conséquent, une augmentation de la résistance à la DLX, ainsi qu'une résistance croisée contre la streptomycine. L'hétérorésistance aux fluoroquinolones a rarement été observée dans les isolats cliniques de quatre agents pathogènes dans une étude précédente et cela a été attribué à la résistance nécessitant des mutations cibles44. Cependant, notre étude montre que dans le SARM, les amplifications génomiques des pompes d'efflux peuvent conduire à une résistance élevée aux fluoroquinolones. L'instabilité des amplifications génomiques conduit probablement à leur sous-détection dans les études de laboratoire et cliniques, et leur rôle dans la résistance aux antibiotiques est donc probablement sous-estimé.

Nous avons quantifié le nombre de copies de l'amplification en utilisant à la fois la qPCR sur l'ADN génomique, ainsi que la profondeur de couverture dans nos échantillons de séquençage du génome entier. Cependant, compte tenu de l'instabilité de l'amplification et de l'hétérogénéité qui en résulte même au sein d'une population autrement isogénique d'une seule souche, un séquençage à longue lecture avec une profondeur de couverture élevée peut être nécessaire pour fournir une mesure plus précise de la distribution du nombre de copies de l'amplification dans une population.

Fait intéressant, 16 types d'amplification génomique distincts de sdrM ont été observés dans nos 13 populations WT indépendantes, et les amplifications étaient dynamiques au sein de chaque population, soulignant davantage leur instabilité. De plus, nous avons observé la même amplification se produire et être sélectionnée dans plusieurs populations indépendantes, ce qui suggère que des cassures et des amplifications de l'ADN peuvent se produire préférentiellement sur certains sites génomiques. La séquence des jonctions d'amplification consistait soit en une microhomologie d'au plus 13 pb, soit en aucune homologie, ce qui est inférieur au seuil de 20 à 40 pb requis pour la recombinaison médiée par RecA14. Cela suggère que la duplication initiale dans nos populations évoluées s'est probablement produite via des jonctions d'extrémité non homologues ou des jonctions d'extrémité alternatives, qui n'ont pas été signalées chez S. aureus à ce jour60.

Les cassures de l'ADN contribuent à la formation d'amplifications génomiques, tant dans les bactéries que dans les systèmes eucaryotes14,61. Les enzymes ADN gyrase et topoisomérase IV soulagent le stress topologique dans l'ADN, générant des cassures double brin de l'ADN de courte durée, qui sont ensuite religaturées. Les fluoroquinolones se lient généralement à l'ADN gyrase ou à la topoisomérase IV dans un complexe avec l'ADN et peuvent à la fois favoriser le clivage de l'ADN et inhiber fortement la religation des extrémités de l'ADN, entraînant une augmentation des cassures double brin de l'ADN62,63. Les antibiotiques fluoroquinolones peuvent ainsi favoriser la formation d'amplifications génomiques et, dans notre étude, nous avons observé une génération et une sélection omniprésentes d'amplifications génomiques contenant sdrM lors d'une exposition à la DLX. Une étude récente a également montré que l'exposition à l'albicidine, poison de l'ADN gyrase, qui bloque également la religation de l'ADN64, a conduit à des amplifications génomiques d'une protéine inhibitrice chez Salmonella Typhimurium et Escherichia coli, et a fourni une résistance à l'albicidine, indiquant en outre que l'inhibition des enzymes de l'ADN topoisomérase peut aider à la formation d'amplifications génomiques65.

On pense que les antibiotiques multi-cibles ou les combinaisons de médicaments réduisent la fréquence de la résistance aux antibiotiques. Cependant, notre étude indique que si l'une des cibles de tels traitements est l'enzyme ADN gyrase ou topoisomérase, elle peut plutôt sélectionner des amplifications géniques qui surviennent en raison de cassures dans l'ADN et conduisent à une évolution rapide de la résistance, et ces amplifications peuvent également entraîner des conséquences supplémentaires imprévues sur la condition physique, y compris la résistance croisée. Une meilleure compréhension des facteurs génétiques et environnementaux qui affectent les amplifications génomiques, ainsi que des trajectoires adaptatives accessibles grâce à la sélection de telles amplifications, en particulier en milieu clinique, est donc nécessaire pour éclairer les nouvelles thérapies antimicrobiennes.

Toutes les souches et tous les plasmides utilisés dans ce travail sont décrits dans le tableau supplémentaire 1. Les isolats cliniques ont été obtenus auprès de la Cystic Fibrosis Foundation Isolate Core du Seattle Children's Hospital et ont été initialement isolés de deux patients différents atteints de fibrose kystique. La distribution de ces isolats est couverte par un protocole IRB approuvé par Seattle Children's n° 14977.

Toutes les expériences en milieu liquide ont été réalisées à 37 °C, sous agitation à 300 rpm, dans un milieu M63 modifié (13,6 g/L KH2PO4, 2 g/L (NH4)2SO4, 0,4 μM citrate ferrique, 1 mM MgSO4 ; pH ajusté à 7.0 avec KOH) additionné de 0,3 % de glucose, 0,1 μg/ml de biotine, 2 μg/ml d'acide nicotinique, 1× Supplement EZ (Teknova) et 1× ACGU solution (Teknova), ou dans Mueller Hinton Broth 2 (MH2) (Millipore sigma) avec ou sans 1× ACGU. Pour le clonage et la construction des souches, les souches ont été cultivées dans des milieux liquides LB (10 g/L de bacto-tryptone, 5 g/L d'extrait de levure, 10 g/L de NaCl) ou sur des plaques LB (contenant 15 g/L d'agar), additionnées de l'antibiotique approprié (10 μg/ml de chloramphénicol, 50 μg/ml d'ampicilline, 10 μg/ml de triméthoprime) ou 0,4 % de para-chlorophénylalanine (PCPA) pour la contre-sélection. Les plaques MH2 ont été préparées avec du MH2-agar (Millipore sigma) et complétées de manière appropriée avec 1 × ACGU et DLX (soit 0, 5, 1 ou 2 μg / ml).

Dix populations indépendantes de cellules de S. aureus JE2 ont été cultivées sous agitation à 300 tr/min à 37 °C dans du milieu M63 modifié, en présence de concentrations croissantes de DLX, avec une dilution quotidienne de 50 à 100 fois dans des tubes à capuchon de 14 ml contenant 2 ml de milieu frais avec DLX. L'évolution a commencé entre 0,05 et 0,25 μg/ml de DLX et la concentration a été augmentée de 1,5 à 2 fois à chaque exposition. Si les souches ne se sont pas développées à la concentration de départ, une concentration de DLX inférieure a été choisie pour initier l'évolution. Au cours de l'évolution, si une population ne montrait pas de croissance visible après un jour, on lui accordait un jour supplémentaire de croissance. S'il n'y avait toujours pas de croissance après deux jours, l'évolution était réinitialisée au passage précédent, et un incrément DLX plus petit était choisi pour le passage suivant. L'évolution a été stoppée soit à 128 μg/ml soit à n'importe quel passage après 8 μg/ml si les populations n'ont pas augmenté à la concentration suivante en deux tentatives. Les détails des populations se trouvent dans l'ensemble de données supplémentaire 1.

Une configuration similaire a été utilisée pour faire évoluer le mutant sdrM :: Tn, où trois populations indépendantes chacune de sdrM :: Tn et WT ont évolué en parallèle, en commençant à une concentration de DLX de 0,1 μg/ml, et les concentrations ont été augmentées de 1,5 à 2 -plier à chaque exposition. De même, pour l'évolution des isolats cliniques, trois populations indépendantes de CF001 et CF106 ont évolué en parallèle à partir d'une concentration en DLX de 0,1 µg/ml pour CF001 et 0,002 µg/ml pour CF106. Les concentrations ont été multipliées par 1,5 à 2 à chaque exposition. L'évolution a été arrêtée comme décrit ci-dessus.

Chacune des dix populations indépendamment évoluées à partir de l'évolution initiale a été étiquetée de P1 à P10. Par conséquent, P1 signifie la 1ère population à évolution indépendante. On introduit un point et un deuxième chiffre qui représente le numéro de passage, par exemple, P1.7 indique le 7ème passage de la 1ère population évoluée. Les lettres apparaissant à la fin de chaque numéro indiquent qu'il s'agissait d'un isolat, par exemple, 1.7a indique un isolat extrait de la population P1.7. Les isolats du dernier passage sont représentés par le numéro de population et une lettre, par exemple, 1a est un isolat du dernier passage dans la population P1.

L'ADN génomique a été préparé à partir de populations et d'isolats sélectionnés à l'aide du kit Qiagen DNeasy Blood and Tissue. Ensuite, des bibliothèques indexées à extrémité unique ou appariée ont été préparées à l'aide du kit de préparation de bibliothèque d'ADN Illumina Nextera XT et séquencées sur un séquenceur Illumina MiSeq ou Nextseq 500. Les données ont été analysées comme décrit précédemment66,67, où les adaptateurs Illumina ont été supprimés à l'aide de cutadapt v4.068, les lectures ont été coupées avec trimmomatic v0.3969, ou les deux étapes effectuées à l'aide de fastp v0.23.267, et les mutations dans les populations évoluées et les isolats ont été identifiés à l'aide de breseq v0.37.170. Les mutations identifiées dans les populations évoluées dans les gènes codant pour les cibles canoniques ou les pompes d'efflux par rapport à la souche parentale, ainsi que toutes les mutations présentes dans les populations à partir du passage terminal de chaque population évoluée indépendamment sont répertoriées dans l'ensemble de données supplémentaire 2. Mutations identifiées dans une population à une fréquence d'au moins 30% était considérée comme présente.

Les génomes des isolats cliniques CF001 et CF106 ont été assemblés à l'aide d'Unicycler v0.4.871 sur PATRIC72 (maintenant intégré au Bacterial and Viral Bioinformatics Resource Center). Les contigs assemblés ont ensuite été annotés à l'aide de Prokka v1.14.673. Ces génomes annotés ont été utilisés comme référence pour identifier les mutations dans les populations évoluées respectives à l'aide de breseq.

Le MLST de CF001 et CF106 a été effectué à l'aide de la base de données PubMLST en ligne (pubmlst.org)74, et le typage SCCmec a été effectué à l'aide de Staphopia-sccmec75.

La profondeur de couverture de chaque paire de bases dans les données de séquençage du génome entier a été déterminée à l'aide de la commande BAM2COV dans breseq v0.37.1. La couverture de toutes les paires de bases a été additionnée pour l'ensemble du génome ou chaque gène d'intérêt, puis a été divisée par la longueur de la séquence (nombre de paires de bases). Le pli de couverture a ensuite été déterminé en divisant le nombre correspondant de lectures par paire de bases du gène par celui du génome entier. Pour identifier les amplifications de sdrM, les échantillons devaient avoir une jonction génomique qui conduisait à l'amplification de sdrM (telle que déterminée par breseq) et atteindre un seuil de couverture de lecture relative de sdrM. Pour les isolats, la couverture relative de sdrM devait être d'au moins 2 × la valeur moyenne de WT (à partir de trois réplicats biologiques), tandis que pour les populations, la couverture relative de sdrM devait être d'au moins 1,3 × la couverture moyenne de WT (pour permettre à la population hétérogénéité). Pour chaque type d'amplification, au moins une instance a été vérifiée par amplification PCR de la nouvelle jonction suivie d'un séquençage Sanger.

Pour les données présentées dans la Fig. 9 supplémentaire, nous avons calculé la couverture normalisée de sdrM, lmrS, sepA et rpoC comme la somme des lectures mappées au gène divisée par la longueur du gène. La couverture normalisée de la pompe à efflux a ensuite été divisée par celle de rpoC, et pour chaque isolat évolué, normalisée à la valeur WT pour obtenir le pli de couverture.

Pour les isolats cliniques, les génomes étant assemblés en contigs, nous avons comparé la couverture de sdrM au contig qui le contient. La profondeur de couverture de chaque paire de bases dans le contig a été déterminée comme ci-dessus. Le facteur de variation de la couverture sdrM a été déterminé en divisant le nombre de lectures par paire de bases de sdrM par celui du contig. Les critères d'identification d'une amplification étaient les mêmes que ci-dessus, sauf que la couverture relative de sdrM a été comparée à la valeur de l'isolat clinique parental respectif.

L'ADN génomique a été extrait d'isolats évolués, et les allèles évolués ont été amplifiés par PCR et clonés dans pIMAY * digéré avec BamHI et EcoRI, en utilisant l'assemblage Gibson76. Le profil de méthylation des plasmides a été adapté à S. aureus après électroporation et extraction des plasmides construits à partir de E. coli IM08B77. L'extraction des plasmides a été effectuée à l'aide du kit Qiagen Plasmid MIDI et les plasmides ont été concentrés à l'aide de Savant SpeedVac SPD1030. Le remplacement allélique a été effectué chez S. aureus JE2 comme décrit76. En bref, les plasmides ont été électroporés dans des cellules S. aureus JE2 et étalés à 30 ° C sur LB Agar + chloramphénicol. Les colonies transformées ont été cultivées sous agitation à 37 ° C dans du milieu LB + chloramphénicol pendant deux nuits, avec une dilution au 1: 1000 dans du milieu frais après la première nuit. Le lendemain, les cellules ont été étalées sur LB Agar + chloramphénicol, et les colonies ont été testées pour l'intégration par PCR avec les amorces d'intégration répertoriées dans le tableau supplémentaire 2. Pour l'excision du plasmide, les colonies qui ont montré une intégration ont été cultivées dans du milieu LB à 25 ° C avec agitation pendant deux nuits, avec une dilution de 1:1000 fois après la première nuit. Les cellules ont ensuite été étalées sur des plaques LB contenant 0,4 % de PCPA, et les colonies ont été criblées en fonction de la taille, les tailles plus grandes étant supposées indiquer l'excision du plasmide. 60 à 100 grandes colonies ont été striées sur des plaques LB avec et sans chloramphénicol pour identifier les clones sensibles au chloramphénicol. La présence de l'allèle mutant a été confirmée par séquençage de Sanger à l'aide des amorces de séquençage (voir tableau supplémentaire 2).

Des assemblages de génomes de 63 986 isolats de S. aureus ont été téléchargés à partir de la base de données NCBI Pathogen Detection (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pathogens/) qui a été consultée le 19 janvier 2023. Les séquences FASTA ont été concaténées et un la base de données locale BLAST a été créée avec la commande NCBI BLAST v2.13.0+ makeblastdb78. La séquence protéique de la séquence JE2 SdrM a été utilisée comme requête pour une recherche tblastn (BLAST traduit) dans la base de données locale, et la sortie a été analysée pour tous les hits qui avaient une couverture de 100 %, un pourcentage d'identité > 85 % et une valeur E. < 10−6. Les fréquences d'acides aminés pour toutes les positions ont été quantifiées à partir de la sortie tblastn BTOP et sont présentées dans l'ensemble de données supplémentaire 3.

Pour construire les souches de surexpression, les gènes WT et les allèles mutants sdrM ont été amplifiés par PCR et clonés dans un vecteur pKK30 amplifié par PCR à l'aide de l'assemblage Gibson. Le produit assemblé Gibson a été électroporé dans des cellules électrocompétentes E. coli DH5α λ-pir et récupéré sur des plaques LB Agar + triméthoprime. Les plasmides ont été extraits des souches d'E. coli et soumis à une électroporation dans S. aureus RN4220. Les plasmides ont été extraits une fois de plus et électroporés dans S. aureus JE2.

Les cellules ont été cultivées pendant 16 h dans 2 ml de M63. 2 ul de ces cellules ont été ajoutés à 198 ul de M63 + 0,1 ug/ml de DLX dans une plaque à 96 puits. La fluorescence de DLX (longueurs d'onde d'excitation et d'émission de λexc = 395 nm et λem = 450 nm respectivement) et la DO600 ont été mesurées toutes les 30 min pendant 19,5 h. Des lectures de fond ont été prises pour les cellules dans M63 sans DLX ou 0,1 ug/ml de DLX, et M63 seul sans DLX ou 0,1 ug/ml de DLX. Étant donné que la fluorescence brute n'a été observée qu'en présence de cellules (Fig. 4a supplémentaire), cela indique probablement une accumulation de DLX à l'intérieur des cellules et peut être utilisé comme indicateur indirect de la DLX intracellulaire. Pour permettre la comparaison entre les échantillons, nous avons normalisé la fluorescence pour la densité cellulaire et soustrait l'autofluorescence des médias et des cellules. La fluorescence normalisée (fluorescence/OD600) a été calculée comme suit :

Étant donné que la densité cellulaire est très faible au départ et que les cellules sont en phase de latence, la fluorescence normalisée aux premiers points de temps montre une grande variabilité en raison des faibles valeurs des termes du dénominateur. Nous montrons donc les données des 12,5 dernières heures dans les figures.

Pour déterminer les taux d'efflux de DLX, nous avons considéré un modèle mathématique simplifié pour ne capturer que l'augmentation de la concentration de DLX à l'intérieur des cellules. Compte tenu de la sélection des mutations sdrM et de l'effet de la surexpression de sdrM sur la résistance à la DLX, nous avons supposé que l'efflux de DLX dépendait principalement de l'activité de SdrM. De plus, étant donné que SdrM est une pompe à efflux et qu'il est peu probable qu'il affecte le métabolisme ou la dégradation de la DLX, ces processus devraient être similaires dans toutes nos souches testées, et nous ne les avons donc pas inclus dans notre modèle. Nous avons défini les équations différentielles suivantes :

où, Cin est la concentration de DLX à l'intérieur de la cellule au temps t, ρin est le taux d'afflux de DLX dans la cellule, Cout est la concentration de DLX à l'extérieur de la cellule au temps t, ρout est le taux d'efflux de DLX hors de la cellule et A = Cout (t = 0) est la concentration initiale de DLX que nous avons utilisée pour l'expérience, 0,1 µg/ml (~0,226 µM). Nous avons supposé que la liaison et la dissociation DLX se produisaient très rapidement et nous n'en tenons pas compte dans nos équations pour plus de simplicité. En résolvant les deux équations ci-dessus, on obtient :

En intégrant cette équation différentielle ordinaire linéaire du second ordre avec Cin (t = 0) = 0, nous obtenons,

où B est une constante arbitraire. Comme la fluorescence normalisée que nous avons déterminée avec le test d'efflux était une approximation de Cin, nous avons effectué un ajustement au moindre carré de Cin avec la fluorescence normalisée en fonction du temps pour sdrM :: Tn, pour déterminer B et ρin, en supposant que le taux d'efflux sera être égal au taux d'influx, ρin = ρout pour le mutant transposon puisque SdrM est absent et le transport de DLX dans et hors de la cellule sera passif. Les valeurs de meilleur ajustement pour B et ρin ont été supposées être les mêmes pour les autres souches. En remplaçant ces valeurs, nous avons effectué un ajustement des moindres carrés pour WT, sdrM1*, sdrM2* et sdrM3* afin de déterminer les valeurs les mieux ajustées pour les taux d'efflux ρout pour chaque souche. Comme nous ajustions Cin à la fluorescence normalisée, les unités des taux d'influx et d'efflux étaient des unités/temps arbitraires (heures).

La DLX a été diluée en série 2 fois dans une plaque à fond transparent plat à 96 puits Corning, pour obtenir huit concentrations. Les cellules cultivées pendant la nuit dans du milieu M63 ou du bouillon Mueller Hinton 2 (MH2) ont été transférées à une dilution finale de 1: 5000 dans la plaque à 96 puits contenant l'antibiotique dilué en série et cultivées à 37 ° C sous agitation pendant 24 h. Après croissance, la DO600 de tous les puits a été mesurée à l'aide d'un lecteur de microplaques Biotek Synergy H1. Les mesures de DO600 pour toutes les concentrations de DLX ont été tracées par rapport aux valeurs de concentration de DLX et ajustées à une fonction de Gompertz modifiée pour déterminer les valeurs exactes de la CMI79. Pour déterminer les CMI multidrogues, WT a été cultivé dans un bouillon MH2 additionné de 1 × ACGU, et 1.7a a été cultivé dans du MH2 additionné de 1 × ACGU avec ou sans 2 µg / ml de DLX pendant la nuit. Le jour suivant, les trois nuits ont été lavées deux fois dans du PBS 1X et les CMI pour tous les antibiotiques ont été déterminées. Le milieu MH2 a été complété avec 1 × ACGU pour des expériences avec 1.7a, car pyrC, un gène impliqué dans la synthèse de la pyrimidine, avait une mutation de décalage de cadre en 1.7a, entraînant une croissance médiocre sans supplémentation en 1 × ACGU.

L'ADN génomique a été extrait comme décrit ci-dessus. L'ARN a été extrait des cellules cultivées pendant la nuit dans M63 à l'aide du kit Total RNA Purification Plus (Norgen Biotek Corp) et l'ADN a été retiré à l'aide du kit TURBO DNA-free™ (Invitrogen). L'ADNc a été synthétisé en utilisant des amorces aléatoires et la transcriptase inverse Superscript III (Thermo Fisher Scientific). Des échantillons d'ADN génomique ou d'ADNc ont été mélangés avec des amorces (voir le tableau supplémentaire 2) et le mélange maître Applied Biosystems Power SYBR Green PCR (Thermo Scientific) dans une plaque de réaction Microamp EnduraPlate Optical 384 Well Clear (Thermo Fisher Scientific) et le qPCR ou RT-qPCR , respectivement, a été exécuté sur une machine de PCR en temps réel QuantStudio 5 (Thermo Fisher Scientific). Le gène rpoC a été utilisé comme contrôle interne pour la qPCR et la RT-qPCR80.

Douze colonies indépendantes pour chaque souche ont été inoculées dans une plaque à 96 puits contenant 200 μl de M63 frais à 37 ° C sous agitation pendant 24 h. Le lendemain, 10 μl de chacun ont été inoculés dans 190 μl de M63 frais contenant 2,5 fois les CMI DLX respectives (sdrM::Tn à 0,32 μg/ml, WT à 0,55 μg/ml, sdrM1* et sdrM2* à 1 μg/ ml et sdrM3* à 1,75 μg/ml) et cultivées pendant 23 h à 37 °C sous agitation. Après 23 h, la DO600 a été mesurée et 10 μl de chaque puits ont été transférés dans une plaque à 96 puits contenant 190 μl de M63 et de DLX frais, et cela a été répété pendant 5 à 14 jours. Pour l'évolution des souches WT et sdrM :: Tn (données présentées à la Fig. 5e), les populations ont été cultivées pendant 24 h supplémentaires après le jour 5 sans transfert, pour permettre potentiellement une croissance et une évolution supplémentaires, afin de permettre des comparaisons entre les deux souches. Les populations qui avaient une DO600 ≥ 0,400 et maintenaient cette croissance de manière constante jusqu'à la fin de l'expérience ont été classées comme résistantes. L'expérience a été arrêtée s'il n'y avait pas de croissance pendant trois jours consécutifs dans l'un des puits.

Le jour 1, les souches ont été inoculées dans du milieu M63 frais et cultivées pendant 24 h à 37 ° C sous agitation sans DLX. Au jour 2, les cellules ont été diluées 1000 fois dans des tubes contenant du milieu frais sans antibiotique ni DLX aux concentrations appropriées. Le même processus a été répété pour le jour 3, et pour chaque souche, il y avait deux répétitions. L'ADN génomique a été extrait chaque jour et le séquençage du génome entier a été effectué. Le nombre de copies sdrM a été déterminé comme décrit ci-dessus.

Les cellules ont été cultivées pendant une nuit dans un bouillon MH2 additionné de 1 × ACGU, et le lendemain, des dilutions en série des cultures ont été déposées sur des plaques de MH2-agar additionnées de 1 × ACGU, sans DLX, ou contenant du DLX à 2 μg/ml, 1 μg /ml, ou 0,5 μg/ml et cultivées dans un incubateur à 37°C pendant une nuit. Le lendemain, les unités formant colonies ont été déterminées.

Les cellules ont été cultivées pendant une nuit dans du M63, diluées à 1:2500 dans du M63 frais et 200 ul ont été transférés dans une plaque à 96 puits. Les plaques ont été incubées dans un lecteur de microplaques Biotek Synergy H1 à 37 °C avec agitation continue à 807 cycles par minute, et la DO600 de la plaque a été mesurée toutes les 30 min pendant 24 h. Pour déterminer la densité cellulaire, des dilutions en série de cultures d'une nuit ont été déposées sur des plaques de gélose LB et cultivées dans un incubateur à 37 ° C pendant la nuit. Le lendemain, les unités formant colonies ont été déterminées.

Les tests et analyses statistiques ont été effectués dans GraphPad Prism v8.4.3.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les assemblages de génomes d'isolats de S. aureus pour analyser la variabilité allélique de SdrM ont été téléchargés à partir de la base de données NCBI Pathogen Detection (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pathogens/). Les données de séquençage du génome entier de cette étude ont été déposées au NCBI Short Read Archive (SRA), associé au BioProject PRJNA904786. Les données sources sont fournies dans ce document.

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Nous tenons à remercier le Center for Cancer Research Genomics Core pour la préparation et le séquençage de la bibliothèque de séquençage du génome entier, et le laboratoire Bose (University of Kansas Medical Center) pour avoir fourni le plasmide pKK30. Nous remercions Tiffany Zarrella pour le séquençage et l'assemblage des génomes des isolats cliniques, ainsi que pour l'assistance au typage SCCmec. Nous remercions Susan Gottesman, Gigi Storz, John Dekker et les membres du laboratoire Khare pour leurs commentaires sur le manuscrit, et les membres des laboratoires Gottesman, Ramamurthi et Khare pour la discussion et les suggestions tout au long de ce travail. Cette étude a utilisé les ressources informatiques du cluster NIH High-Performance Computing Biowulf (http://hpc.nih.gov). Ce travail a été soutenu par le programme de recherche intra-muros du NIH, du National Cancer Institute et du Center for Cancer Research.

Financement en libre accès fourni par les National Institutes of Health (NIH).

Laboratoire de biologie moléculaire, National Cancer Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 20892, États-Unis

Kalinga Pavan T. Silva, Ganesh Sundar et Anupama Khare

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GS a réalisé les expériences d'évolution originales, KPTS a réalisé toutes les autres expériences, KPTS et AK ont analysé les données et rédigé le manuscrit, AK a supervisé la recherche.

Correspondance à Anupama Khare.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Tobias Bollenbach, Theresa Fink et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Un dossier d'examen par les pairs est disponible.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Silva, KPT, Sundar, G. & Khare, A. Les amplifications géniques de la pompe à efflux contournent la nécessité de multiples mutations cibles pour la résistance aux antibiotiques à double ciblage. Nat Commun 14, 3402 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38507-4

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Reçu : 07 décembre 2022

Accepté : 05 mai 2023

Publié: 09 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-023-38507-4

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