Les éditeurs de base et les éditeurs principaux commencent à réaliser leur promesse clinique

L'équipe scientifique d'EmendoBio s'appuie sur les plateformes exclusives de la société pour développer des thérapies CRISPR de nouvelle génération. Une plate-forme de découverte de nucléases est utilisée pour élargir la gamme ciblable du génome, et une plate-forme d'optimisation spécifique à la cible est utilisée pour permettre l'édition de gènes très précise, y compris l'édition spécifique d'allèles, tout en maintenant des rendements élevés et en évitant les effets hors cible. La société affirme qu'elle peut concevoir des nucléases et des guides d'ARN sur mesure pour de nombreuses maladies qui étaient auparavant considérées comme incurables.

Par MaryAnn Labant

En 2016, un groupe de chercheurs dirigé par David Liu, PhD, de Harvard, a publié un article dans Nature qui faisait état du développement de l'édition de base. L'édition de base, ont-ils écrit, est "une nouvelle approche de l'édition du génome qui permet la conversion directe et irréversible d'une base d'ADN cible en une autre de manière programmable, sans nécessiter de clivage du squelette d'ADN double brin ou d'un modèle donneur". Ils ont ajouté que l'édition de base pouvait réduire le risque de mutations hors cible et avait le potentiel de "corriger efficacement une variété de mutations ponctuelles pertinentes pour la maladie humaine".

Un travail similaire à l'époque a été accompli par Keiji Nishda, PhD, et ses collègues de l'Université de Kobe. De nombreux systèmes d'édition de base supplémentaires ont été développés par des chercheurs universitaires et commerciaux au cours des années qui ont suivi. Et ce n'est pas tout. En 2019, un autre système d'édition du génome capable d'éviter les cassures d'ADN double brin a été introduit. Ce système s'appelle l'édition principale, et il a été développé, pas par hasard, par des chercheurs dirigés par Liu.

"[L'édition principale est] une méthode d'édition du génome polyvalente et précise qui écrit directement de nouvelles informations génétiques dans un site d'ADN spécifié à l'aide d'une endonucléase Cas9 catalytiquement altérée fusionnée à une transcriptase inverse modifiée, programmée avec un ARN guide d'édition principal (pegRNA) qui spécifie à la fois le site cible et encode la modification souhaitée », ont écrit les chercheurs dans Nature. "L'édition principale… présente des forces et des faiblesses complémentaires par rapport à l'édition de base et induit une édition hors cible beaucoup plus faible que la nucléase Cas9 sur les sites hors cible connus de Cas9. L'édition principale élargit considérablement la portée et les capacités de l'édition du génome et, en principe, pourrait corriger à 89 % des variants génétiques connus associés aux maladies humaines. »

Aujourd'hui, des systèmes d'édition de base et d'édition principale pour des applications cliniques sont en cours de développement. Plusieurs de ces systèmes sont mis en évidence dans cet article. Bien que ces systèmes soient à la pointe de la technologie, ou plutôt à la fine pointe, ils doivent encore relever des défis familiers tels que l'emballage et la livraison ciblée.

"Nous pensons que l'édition principale est très spécifique et précise car la machinerie d'édition principale doit passer par trois étapes de recuit pour effectuer un changement génétique", déclare Keith Gottesdiener, MD, président et chef de la direction de Prime Medicine. "Il est peu probable qu'il atterrisse au mauvais endroit et déverrouille les trois clés."

Selon Gottesdiener, l'édition principale peut corriger les 12 incompatibilités différentes d'une seule paire de bases, réparer les petites mutations indel et supprimer et remplacer les grandes séquences génomiques, le tout de manière programmable. "Dans le montage programmable, le montage est précisément ciblé", souligne-t-il. "Nous pouvons choisir, sur une paire de bases, où nous voulons qu'une modification se produise. Et puisque la machinerie fonctionne et est guidée par un petit ARNg, nous pouvons l'échanger et passer à un autre endroit du génome."

L'édition principale fonctionne dans une vaste gamme de cellules qui se divisent rapidement ou quiescentes. Un traitement unique, l'ADN est ramené au type sauvage au locus génétique normal.

"Nous avons amélioré et amélioré la technologie d'origine", affirme Gottesdiener. "C'est presque trop beau pour être vrai." Il prévient cependant que "la fourniture de la technologie à n'importe quel site présente des défis similaires à ceux rencontrés par d'autres". Les options de livraison familières comprennent l'électroporation pour les applications ex vivo ; les nanoparticules lipidiques (LNP) pour cibler le foie ; et des vecteurs de virus adéno-associés (AAV) pour cibler d'autres emplacements stratégiques.

Prime Medicine dispose d'un large pipeline. Bien qu'un tel pipeline offre à l'entreprise une gamme d'options, il pose également un défi de gestion. "Toutes les indications pourraient avancer à la clinique", note Gottesdiener. "Cependant, certains programmes progresseront plus rapidement, certains avec lesquels nous nous associerons et d'autres seront élagués."

Dans le pipeline initial, l'accent est mis sur les indications immédiates et les programmes de différenciation. Prime a sélectionné ces indications après avoir équilibré des considérations telles que la génétique définie, les priorités médicales émergentes, les contributions des partenaires leaders d'opinion de Prime et les défis réglementaires et de livraison. Le programme de différenciation se concentre sur les caractéristiques uniques de la maladie, telles que la lutte contre les expansions répétées trouvées dans la maladie de Huntington, une forme de sclérose latérale amyotrophique et certaines formes d'ataxie. Prime prévoit de soumettre une IND pour sa première indication, la maladie granulomateuse chronique, en 2024.

Giuseppe "Pino" Ciaramella, PhD, président de Beam Therapeutics, observe que l'édition de base modifie la technologie basée sur CRISPR de deux manières essentielles. Premièrement, l'édition de base n'a pas besoin de faire des ruptures double brin, ce qui peut entraîner des réarrangements génomiques et d'autres conséquences indésirables. Deuxièmement, l'édition de bases fusionne généralement la protéine CRISPR avec une protéine humaine supplémentaire, une désaminase capable de convertir chimiquement une nucléobase en une autre directement sur le gène.

Une limitation des éditeurs de base est qu'ils n'effectuent que certains types d'éditions de paires de bases uniques. Autrement dit, ils ne peuvent effectuer que des mutations de transition (purine à purine ou pyrimidine à pyrimidine), et non des mutations de transversion (purine à pyrimidine ou pyrimidine à purine). Ils ne peuvent pas être utilisés pour effectuer des insertions ou des délétions ou pour remplacer n'importe quel segment d'ADN souhaité. Néanmoins, parce qu'ils sont des outils capables de faire des mutations de point de transition avec une grande précision et efficacité, les éditeurs de base ont un potentiel dans une variété d'applications thérapeutiques.

L'absence de ruptures double brin confère un avantage significatif en permettant plusieurs montages simultanés. Un système qui exploite ces modifications simultanées est une plate-forme Beam appelée Engineered Stem Cell Antibody Paired Evasion (ESCAPE). Il combine le conditionnement à base d'anticorps avec des cellules souches hématopoïétiques modifiées par gène multiplex.

"Nous pouvons faire une modification visant à modifier la drépanocytose ainsi qu'une modification qui rend les cellules modifiées résistantes à un anticorps sur mesure qui peut cibler sélectivement les cellules non modifiées et créer une niche dans la moelle osseuse qui permet aux cellules modifiées de se greffer après une greffe », explique Ciaramella. Cela peut permettre un régime de conditionnement non toxique, contrairement au régime de soins standard actuel, qui peut entraîner la stérilité et d'autres effets secondaires.

La société utilise des technologies de livraison cliniquement validées pour fournir l'ARNm codant l'éditeur. Les programmes ex vivo utilisent l'électroporation et les programmes in vivo encapsulent l'ARNm dans des LNP qui peuvent cibler le foie. De nouvelles formulations de LNP sont en cours de développement pour cibler d'autres tissus comme les cellules immunitaires ou les cellules souches de la moelle osseuse.

Le programme principal de Beam pour la drépanocytose, BEAM-101, est le premier programme d'édition de bases cliniques aux États-Unis. Ciaramella note que le paquet réglementaire de Beam était conforme à celui requis pour d'autres programmes d'édition de gènes ex vivo.

En plus de développer sa technologie d'édition de base, Beam collabore avec d'autres sociétés. Grâce à un accord avec Prime Medicine, Beam a le droit exclusif de développer une technologie d'édition principale pour la création ou la correction de toute mutation de transition à base unique, ainsi que pour le traitement de la drépanocytose. De plus, Beam travaille avec Verve Therapeutics. Dans le cadre de cette collaboration, Verve a un accès exclusif aux technologies d'édition de bases, d'édition de gènes et d'administration de Beam pour des applications thérapeutiques humaines contre certaines cibles cardiovasculaires. Bien que Beam ait également accès à la technologie d'édition d'ARN, la société, selon Ciaramella, n'a pas trouvé d'applications où l'édition d'ARN offrirait un avantage par rapport à l'édition d'ADN.

Le cardiologue et scientifique Sekar Kathiresan, MD, met en lumière trois idées sur les maladies cardiovasculaires qui ont émergé de la recherche en génétique humaine. Premièrement, si le taux de cholestérol sanguin d'un individu est bas tout au long de sa vie, il est très peu probable qu'il développe une crise cardiaque. Deuxièmement, certaines personnes résistantes aux maladies cardiaques sont porteuses de mutations - des mutations de résistance - qui désactivent naturellement les gènes responsables de l'augmentation du cholestérol. Troisièmement, trois des mutations de résistance affectent la voie du cholestérol des lipoprotéines de basse densité (LDL), quatre d'entre elles affectent la voie du cholestérol des lipoprotéines riches en triglycérides (TRL) et l'une d'entre elles affecte la lipoprotéine (a) (Lp (a)) voie du cholestérol.

« La technologie CRISPR nous a permis de développer un médicament qui imiterait ces mutations de résistance naturelle », poursuit Kathiresan. Par « nous », il entend l'équipe de développement de Verve Therapeutics, la société de médicaments génétiques dont il est cofondateur et PDG. "Nos médicaments d'édition de gènes à usage unique", affirme-t-il, "sont conçus pour abaisser de façon permanente le cholestérol sanguin".

VERVE-101, le produit candidat le plus avancé de la société, cible le gène PCSK9 pour abaisser les taux de cholestérol LDL. VERVE-201, le prochain produit candidat le plus avancé de la société, cible le gène ANGPTL3 pour abaisser les taux de cholestérol TRL. Les programmes VERVE-101 et VERVE-201 reposent sur la technologie d'édition de base. Pour cibler le gène LPA et réduire les niveaux de cholestérol Lp(a), Verve conçoit un éditeur personnalisé.

La livraison bénéficie du raffinement. Les TNL standard sont de petites bulles de graisse qui transportent des marchandises. Dans le cas de VERVE-101, la cargaison est l'ARNm de l'éditeur de base CRISPR ainsi qu'un ARNg qui dirige l'éditeur vers le gène PCSK9. "Nous avons ajouté un ligand, une molécule de sucre GalNAc, à un LNP standard", explique Kathiresan. "Étant donné que le récepteur GalNAc n'est exprimé que sur les hépatocytes, un GalNAc LNP a le potentiel d'être plus puissant et plus spécifique."

VERVE-101 fait actuellement l'objet d'un essai de phase I, appelé heart-1, pour évaluer l'innocuité et l'efficacité chez les patients atteints d'hypercholestérolémie familiale hétérozygote (HeFH), une forme génétique d'hypercholestérolémie et de maladie cardiaque prématurée. Maladie morbide, l'HeFH se caractérise par des taux sanguins très élevés de cholestérol LDL et une maladie cardiovasculaire athéroscléreuse prématurée. Les schémas thérapeutiques actuels de réduction du cholestérol LDL de pilules quotidiennes ou d'injections intermittentes imposent une lourde charge de traitement aux patients, aux prestataires et au système de santé, et moins de 5 % des patients atteints d'HFHe dans le monde atteignent les niveaux cibles de cholestérol LDL.

L'essai heart-1 est actuellement en cours de recrutement en Nouvelle-Zélande et au Royaume-Uni. Les données cliniques sont attendues plus tard cette année. La société travaille avec la FDA pour ouvrir un IND aux États-Unis.

Les applications cliniques de la technologie CRISPR-Cas9 doivent démontrer leur innocuité et leur flexibilité, déclare David Baram, PhD, président et chef de la direction d'Emendo Biotherapeutics. La sécurité, suggère-t-il, consiste en grande partie à éviter les effets hors cible. "CRISPR- Cas9 cible principalement ce que vous voulez qu'il coupe", déclare Baram. "Mais la plupart du temps, ce n'est pas suffisant pour la sécurité dans sa forme de type sauvage." En ce qui concerne la flexibilité, il insiste sur le besoin de solutions multiples : "Pour être en mesure de traiter la maladie de la manière la plus efficace, un portefeuille de stratégies d'édition permet de cibler davantage de maladies et de loci sur des gènes spécifiques."

La nucléase la plus connue dans l'édition de gènes est peut-être la variante Cas9 isolée de la bactérie Streptococcus pyogenes (SpCas9). Il existe cependant des milliers d'autres nucléases, dont certaines sont supérieures en termes d'activité, de nombre de sites qu'elles peuvent cibler, de spécificité et d'efficacité de conditionnement. Un panel de nucléases offre la possibilité de trouver la meilleure nucléase pour traiter une maladie spécifique. « Nos nucléases sont très actives et très précises, et elles peuvent cibler 90 % du génome humain », affirme Baram. "SpCas9 couvre moins de 10 %."

Une équipe d'experts en informatique et de scientifiques génère le panel de nucléases. La plateforme d'ingénierie de la société adapte ensuite ces nucléases sauvages à des fins spécifiques. Un exemple est l'édition spécifique d'allèle d'une maladie autosomique dominante dans laquelle il existe un allèle sain et un allèle muté. "Nous pouvons cibler l'allèle muté même s'il ne présente qu'une différence mineure d'un seul nucléotide", déclare Baram. Cela a ouvert une fenêtre sur le traitement des maladies autosomiques dominantes en une seule étape.

L'indication principale d'Emendo est la neutropénie congénitale sévère, un trouble de la maturation des neutrophiles qui finit par provoquer une immunodéficience, rendant les patients très sensibles aux infections bactériennes. Le traitement standard de la maladie comprend des injections de facteur de stimulation des colonies de granulocytes, qui peuvent aider à restaurer la fonction du système immunitaire. Pour traiter et, espérons-le, guérir la maladie, Emendo a développé une nouvelle stratégie d'édition de gènes ex vivo basée sur CRISPR (OMNI A1), qui implique l'excision spécifique d'un allèle mutant pathogène du gène ELANE. Emendo prévoit qu'il soit dans la clinique d'ici la fin de 2023.

Un traitement de l'hypercholestérolémie familiale est également en préparation. Ce traitement consiste à cibler le gène LDLR (qui code le récepteur LDL) plutôt que le gène PCSK9 (qui code une protéine qui régule l'expression du récepteur LDL) pour élever le niveau d'expression du récepteur LDL à la surface des hépatocytes et prélever le cholestérol LDL du sang dans les cellules. La stratégie d'édition excise un élément régulateur dans le gène LDLR qui influence directement les niveaux d'expression du récepteur LDL à la surface de la membrane. Les données montrent que l'utilisation de l'approche élève les niveaux d'apport cellulaire LDL trois fois plus que l'élimination de PCSK9 et l'administration de statines combinées.

La plate-forme d'édition de base Pin-point™ de Revvity pour les sciences de la vie intègre les éléments suivants : un ARNg ; une nickase (basée sur Cas9 ou une protéine similaire pour éviter de créer des cassures d'ADN double brin) ; et une désaminase (ou une autre molécule effectrice). Le système est assemblé à l'aide d'un aptamère sur l'ARNg et d'une protéine de liaison à l'aptamère sur la désaminase ou une autre molécule effectrice.

Qu'est-ce qui distingue la plate-forme d'édition de base Pin-point des autres systèmes d'édition de base ? Avec la plate-forme d'édition de base Pin-point, la désaminase et la nickase ne sont pas fusionnées l'une à l'autre. Différentes désaminases et nickases peuvent être échangées indépendamment.

"En utilisant un ARNg sans aptamère, il est possible de cibler la fonction d'entaille du nCas9 pour insérer des séquences d'ADN dans des sites ciblés du génome", explique Michelle Fraser, PhD, responsable d'unité commerciale, Pin-point Base Editing Platform, Revvity pour les sciences de la vie. "Cela permet l'édition multiplex, provoquant l'inactivation de gènes ou la correction d'erreurs génétiques au niveau de la base unique et également, simultanément, l'insertion de gènes."

La plate-forme d'édition de base Pin-point a obtenu une conversion de base > 75 % de C à T à l'aide d'un éditeur de base de cytosine dans une édition multiplex de quatre locus immunogènes différents (B2M, CD52, PDCD1 et TRAC) dans les cellules T. Ces quatre loci ont été éliminés dans plus de 50 % des populations de cellules éditées.

La plate-forme d'édition de base Pin-point a également été utilisée pour générer des lymphocytes T chimériques récepteurs d'antigène (CAR) dans lesquels ces quatre mêmes marqueurs immunogènes ont été éliminés et le CAR ciblant CD19 a été activé. Un test de destruction des cellules tumorales a confirmé que ces Les cellules CAR T étaient très efficaces. L'édition de bases multiplex a également été démontrée dans des cellules souches pluripotentes induites avec une efficacité similaire.

La plate-forme d'édition de base Pin-point peut être concédée sous licence par Revvity pour les sciences de la vie. De plus, un service de criblage en mosaïque est disponible, où la plate-forme Pin-point est utilisée pour éditer chaque résidu C disponible dans un gène cible ou des gènes d'intérêt. Les phénotypes des cellules éditées sont ensuite utilisés pour identifier les domaines fonctionnels ou caractériser les variantes génétiques suspectées.

La gamme d'enzymes - variantes de Cas, nickases, désaminases et autres effecteurs - se développe rapidement grâce à des programmes de découverte d'enzymes qui étudient des sources de biodiversité, ainsi qu'à des projets d'ingénierie des protéines et d'évolution dirigée en laboratoire. Selon Revvity pour les sciences de la vie, la modularité de la plate-forme d'édition de base Pin-point offre une opportunité unique de remplacer la nickase et/ou la désaminase par des variantes nouvellement développées.

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